L'entérotoxine NSP4 des rotavirus
est
homologue à la toxine
(chlorotoxine et apparentée Buthus
eupeus BeI1)
de scorpion se liant à un canal
chlore.
Tran M K G. 1,2, Kirkiacharan S. 2, Caprani A. 3, Maurisson G.4
1 A
Université Paris V René Descartes
;
Correspondance : 31, Av du Bois - 92290
Châtenay-Malabry, France. Tél : (01) 46 30 12
53.
2 Chimie Thérapeutique (Pr Kirkiacharian S.),
Université Paris XI, Faculté de Pharmacie, rue
Jean-Baptiste Clément, 92290 Châtenay
Malabry.
3 Université Paris Jussieu, Tour 33. E-mail :
Caprani@ccr.jussieu.fr
4 Centre Médical Europe, 44 rue d'Amsterdam, 75009
Paris..
Les
diarrhées à rotavirus frappent environ 125
millions de victimes, surtout de jeunes enfants (de 12
à 23 mois), dont 18 millions peuvent être
considérés comme sévèrement
atteints, avec une incidence de 873 000 décès
d'enfants de 1 à 4 ans par an dans les pays pauvres,
en voie de développement (Parashar U.D., 1998). Aucun
vaccin n'est encore disponible chez l'homme actuellement, le
dernier candidat en date, le Rotaschieldâ ayant entraîné des complications à type
d'invagination intestinale chez le nourrisson (Vesikari T.,
2000 ; Cohen J., 2001). Un nouveau vaccin vivant,
atténué 89-12 en cours semble donner, avec un
recul de 2 ans, une protection de 76% (Bernstein D.I.,
20002).
Objectif :
Analyser le rotavirus et
en particulier ses protéines impliquées dans
la survenue de la diarrhée, comme NSP4 (Non
Structural Protein 4), VP6 et VP4 (Viral Protein).
Méthodes :
La comparaison des
séquences en acides aminés, en tenant compte
des résidus du site actif fonctionnel biologiquement, et de l'analyse de
la structure tridimensionnelle (3D).
L'analyse statistique est
faite selon Oldstone M.B.A. (1987), qui assure qu'il existe
20 Acides Aminés (AA), que chacun d'entre eux est
pondéré du même coefficient unitaire 1.
Donc, par exemple, si le mimétisme moléculaire
porte sur 6 résidus identiques successifs, il y a 1
chance sur 20 puissance 6 (206 = 20x20x20x20x20x20 = 64 000
000) pour que ce soit dû au simple hasard, selon la
loi des grands nombres. Un mimétisme
moléculaire est statistiquement significatif à
partir de la taille de l'hexapeptide (6 AA, 6 acides
aminés).
Les abréviations employées en peptidologie sont : A = Ala, Alanine ; B = Asn ou Asp, Asparagine ou Acide Aspartique ; C = Cys ou Cystéine ; D = Asp ou Acide Aspartique ; E = Glu ou Acide Glutamique ; F = Phe ou Phénylalanine
; G = Gly ou Glycine ; H = His ou Histidine ; I = Iso ou Isoleucine ; K = Lys ou Lysine ; L = Leu ou Leucine ; M = Met ou Méthionine ; N = Asn ou Asparagine ; P = Pro ou Proline ; Q = Gln ou Glutamine ; R = Arg ou Arginine ; S = Ser ou Sérine ; T = Thr ou Thréonine ; V = Val ou Valine ; W = Trp ou Tryptophane ; X = inconnu ; Y = Tyr ou Tyrosine ; Z = Gln ou Glu, Glutamine ou Acide Glutamique.
Sont analysés les
membres de la famille de la chlorotoxine de Lqq (Leiirus
quinquiestratus quinquiestratus) [1910194A] et
apparentés (chlorotoxine-like BeI1) à cette
famille : En particulier, Buthus eupeus BeI1 (Zhdanova L.N.,
1977) est
considéré comme une
chlorotoxine-like,
en raison des 4 résidus L, R, K, Y du site actif
retrouvés en
3D dans les 2
toxines, bien que linéairement les 2 Y ne soit pas
alignés. Cependant, aucune étude
électrophysiologique n'a encore été
réalisée avec BeI1. Cette famille comprend en
plus : BTChl1 [GI :19387532], BTChl2, CT de BmK (Buthus
Martensii Karsch) [GI : 5712119] et probablement Bs (Buthus
sindicus) [P15229].
Résultats :
Nous trouvons que la
séquence de la protéine NSP4, qui est
considérée comme une " entérotoxine "
virale, en particulier le peptide 114-135
DKLTTREIEQVELLKRIYDNLI impliqué dans la
diarrhée, est homologue à un venin de scorpion
: Chlorotoxine, mais surtout la chlorotoxine-like Be I1
(Zhdanova L.N., 1977) de Buthus eupeus, un scorpion noir du
Caucase. Avec la chlorotoxine de Lqq, on retrouve les 4
résidus du site actif L, R, K et Y en 3D (Lippens G.,
1995) :
Le centrage de
l'alignement linéaire se fait sur une cystéine
C (C 129), heureusement
présente dans une souche de rotavirus, la souche RV3,
qui contient la séquence 127-LKCIYD-132, au lieu du consensus
habituel 127-LKRIYD-132 (Lee C-N., 2000). Grâce
à ce centrage linéaire cystéine
C très solide, on trouve en aval la
séquence YD identique dans NSP4 et la
chlorotoxine, contenant Y un résidu du site actif, et
en amont une leucine L, un autre résidu du site
actif de la chlorotoxine-like BeI1.
Ensuite, en partant de ce
patch linéaire ancré sur la cystéine
C, on développe en 3D
[structure de rotavirus NSP4 à Protein Data Base :PDB
:1G1J (Bowman G.D., 2000) et structure 3D (Arseniev A.S.,
1984), de la toxine de scorpion Buthus eupeus BeI5A (Grishin
E.V., 1982) dont la séquence en acides aminés
est quasi-identique à celle de BeI1,
sauf au niveau de 2 résidus du
site actif : [N au lieu de R, et R au lieu de Y], en recherchant les autres
résidus cruciaux dans l'environnement du patch du
site actif, à savoir R et K. En 3D, on observe le
rapprochement de RGKCF de YD au niveau de la chlorotoxine-like
BeI1. Les résidus en gras, soulignés par une
astérisque, représentent les AAs du
site
actif de la
chlorotoxine-like BeI1. Tous les résidus de ce site
(R, K, L, Y) sont retrouvés dans
NSP4.
De plus, la
mutation 50 (L-->F) de la
séquence 46-LLRKF-50 [les numérotations ne
correspondent pas d'un auteur à l'autre : le
résidu 50 est ici l'équivalent du
résidu 130] qui atténue NSP4 (souche Cowden
atténuée de rotavirus porcin du groupe C)
(Chang K.O., 1999) est exactement située dans le site actif,
juste à côté de L, R et de K. En 3D, elle correspond au
résidu F de la séquence RGKCF de la chlorotoxine-like BeI1.
Même en alignement linéaire, on devine qu'il y
a correspondance, en insérant 2 gaps :
Un autre
résultat vient conforter cette homologie :
L'étude, cette fois-ci, du récepteur de la chlorotoxine, c'est à
dire le canal chlorique voltage-dépendant, montre que
ce récepteur contient, au niveau d'une
boucle
extra-cellulaire,
une séquence 32-LGETQEEEDEILPRKDYESL-51 homologue à NSP4
(nous avons pris la souche Cowden, car elle contient R suivi
de K) (en particulier, on y retrouve groupés en un
patch linéaire tous les résidus du site actif
de la chlorotoxine-like BeI1 : L, R, K, Y :
Il est intéressant
de noter que la toxine du venin de scorpion a la
propriété de modifier le cytosquelette et de
précipiter le calcium de la cellule qu'elle intoxique
(Brown G.B., 1983), ce qui est tout à fait similaire
aux modifications du cytosquelette (Brunet J-P., 2000) et
à l'effet calcium-dépendant induit par le
rotavirus sur la cellule-cible épithéliale
intestinale (Ruiz M.C., 2000).
Le plus intéressant
est certainement le phénomène de
VACUOLISATION
ou BALLONISATION des entérocytes de la
villosité intestinale, observé lors de
l'infection à rotavirus (revue dans : Pothier P.,
1998). C'est extrêmement significatif, car c'est aussi
la marque d'une intoxication par la toxine du venin de
scorpion : en effet, la toxine du venin gonfle la cellule
par un mécanisme d'entrée ionique suivi par un
accompagnement osmotique d'eau ; le tout résulte en
l'apparition de vacuole énorme très
évocatrice d'une physiopathologie du type venin de
scorpion (Love S., 1986). L'aphorisme : " Vacuole cellulaire
= toxine du venin de scorpion " doit rester constamment
présent à l'esprit.
L'infection par le
rotavirus provoque une gastro-entérite fébrile
avec diarrhée, douleurs abdominales et vomissements.
Il en est exactement de même de l'envenimation par la
piqûre de scorpion, dont le tableau inclut presque
constamment une diarrhée, des douleurs abdominales
avec vomissements. On peut même parfois observer des
convulsions en cas de gastro-entérite à
rotavirus (Nishimura S., 1993), et l'on sait que les
convulsions sont un signe fréquent des envenimations
scorpioniques.
Il est intéressant
de noter que la toxine du venin de scorpion a la
propriété de modifier le cytosquelette et de
précipiter le calcium de la cellule qu'elle intoxique
(Brown G.B., 1983), ce qui est tout à fait similaire
aux modifications du cytosquelette (Brunet J-P., 2000) et
à l'effet calcium-dépendant induit par le
rotavirus sur la cellule-cible épithéliale
intestinale (Ruiz M.C., 2000).
Le plus intéressant
est certainement le phénomène de VACUOLISATION
ou BALLONISATION des entérocytes de la
villosité intestinale, observé lors de
l'infection à rotavirus (revue dans : Pothier P.,
1998). C'est extrêmement significatif, car c'est aussi
la marque d'une intoxication par la toxine du venin de
scorpion. En effet, la toxine du venin gonfle la cellule
par un mécanisme d'entrée ionique suivi par un
accompagnement osmotique d'eau ; le tout résulte en
l'apparition de vacuole énorme très
évocatrice d'une physiopathologie du type venin de
scorpion (Love S., 1986). L'aphorisme : " Vacuole cellulaire
= toxine du venin de scorpion " doit rester constamment
présent à l'esprit.
L'infection par le
rotavirus provoque une gastro-entérite fébrile
avec diarrhée, douleurs abdominales et vomissements.
Il en est exactement de même de l'envenimation par la
piqûre de scorpion, dont le tableau inclut presque
constamment une diarrhée, des douleurs abdominales
avec vomissements. On peut même parfois observer des
convulsions en cas de gastro-entérite à
rotavirus (Nishimura S., 1993), et l'on sait que les
convulsions sont un signe fréquent des envenimations
scorpioniques.
L'administration
intra-péritonéale ou intra-iléale de
NSP4 ou du simple peptide 114-135, d'une longueur de 22
résidus -ce qui est approximativement la longueur
d'une toxine courte de scorpion- est capable d'induire une
diarrhée (Ball J.M., 1996).Cet effet est dose -et
âge- dépendant (l'envenimation scorpionique
aussi est dose -et âge- dépendant, la
mortalité s'observant surtout chez les enfants, de
petit poids corporel comparé à l'adulte), est
spécifique puisque inhibé par des anticorps
anti-NSP4. De plus, cette protéine est
retrouvée dans les selles diarrhéiques des
souris infectées par le rotavirus. Au contraire, elle
n'est pas décelable dans les selles de souris sans
diarrhée. Les données
électrophysiologiques sur la muqueuse intestinale suggèrent que la protéine NSP4 induit une
diarrhée en agissant comme une entérotoxine.
Cette protéine où le peptide 114-135 augmente la
sécrétion de chlore et d'eau en agissant sur
un récepteur signal de la voie
calcium-dépendante. Les mouvements ioniques, en
particulier de l'ion chlore, ont été mis en
évidence dans la diarrhée à rotavirus
(Lorrot M., 2002). La protéine purifiée NSP4
du rotavirus est capable d'induire une diarrhée chez
le souriceau de 6 à 10 jours. Cette réponse
à NSP4 disparaît chez les souriceaux plus
âgés. La décroissance, avec l'âge,
du nombre de récepteur au NSP4 sur la muqueuse
intestinale expliquerait l'âge de survenue de la
diarrhée à rotavirus.
Le récepteur du
NSP4 n'est pas connu à l'heure actuelle, mais
l'homologie moléculaire de NSP4 avec la
chlorotoxine-like BeI1 fait penser qu'il serait très
probablement un canal chlorique transmembranaire
voltage-dépendant. En effet, il existe une
séquence, située à la partie
extra-cellulaire 32-LGTETQEEEDEILPRKDYESL-51 de ce récepteur
ionique qui s'aligne avec le ligand, laissant penser que la
chlorotoxine-like BeI1 pourrait se fixer au pore du canal en
se plaçant de façon
compétitive
avec la partie extra-cellulaire 32-51 sur et/ou dans le pore
transmembranaire. En quelque sorte, la loi
générale est qu'un ligand ressemble à
la partie (une boucle) extra-cellulaire du récepteur, ce qui lui
permet de se mettre à la place de celle-ci. Nous
avons trouvé plusieurs exemples de ce genre
d'homologie ligand - boucle extra-cellulaire du
récepteur (Tran M.K.G., non publié) : bien
sûr, évidemment, seule la partie
extra-cellulaire ressemble au ligand. Citons le cas
du virus d'Epstein-Barr et la partie extra-cellulaire du
récepteur du complément, la
cholécystokinine-pancréazymine (C.C.K.P.Z.),
et la partie extra-cellulaire du canal sodique
voltage-dépendant, un épitope de l'enveloppe
du VIH1 et la partie extra-cellulaire du CCR5.
Un médicament se
fixant et modifiant ce canal chlore pourrait constituer un
anti-rotavirus spécifique.
D'une façon plus
générale, la théorie du venin de
scorpion appliquée aux virus a fait l'objet de
recherches anciennes remontant déjà à
13 ans (Tran M.K.G.,1989 ; Werner T., 1991) ; elle a
été récemment confirmée par une
étude sur les très rares (environ 1%) malades
infectés par le VIH-1 survivants à long terme
après plus de 15 ans sans aucun traitement : leur
immunité naturelle vis-à-vis du VIH-1
s'explique par la présence à des taux
élevés de protéines
particulières ou défensines-a1,2,3
protectrices contre le VIH-1 (Zhang L., 2002). Or il est
connu que les défensines-a font
partie de la famille des venins de scorpions (Bontems F.,
1991) : ainsi le modèle " venin de scorpion du Sida "
que nous défendons depuis 1989 est tout à fait
cohérent avec les dernières données.
Levy J. a montré que les lymphocytes infectés
par le VIH-1 se " ballonisaient " en s'arrondissant et en
gonflant ("balloon cells"), de façon tout à
fait similaire aux entérocytes du sommet villositaire
dans l'infection à rotavirus.
Conclusion
:
Il existe une homologie
moléculaire tridimensionnelle très
significative entre les 2 toxines de venin de scorpion
chlorotoxine [et surtout Be I1 (chlorotoxine-like)] qui se
fixe sur un canal ionique chlore et l'entérotoxine
virale NSP4 du rotavirus, impliqué dans la survenue
de la diarrhée. Ce résultat est
cohérent avec les modifications du flux ionique
chlorique Cl- induit par NSP4 et la vacuolisation des
entérocytes provoquée par le rotavirus. Ce
motif peut être utilisé pour la mise au point
d'un vaccin multi-épitopique, présenté
par la protéine de choc thermique ou Heat Shock
Protein (HSP) aux cellules dendritiques (Srivastava P.,
2002). D'autres résultats sur la VP6,
spécifique de groupe, font penser qu'elle est aussi
un venin de scorpion, modifiant les flux ioniques sodique
et/ou potassique (Na+, K+) (homologie entre VP6 et longue
toxine de scorpion, ligand du canal sodique Na+
voltage-dépendent) (Tran M.K.G., travail
préliminaire). En effet, la lidocaïne, un ligand
du canal sodique Na+ voltage-dépendent (Catterall), a
un effet bénéfique contre le rotavirus en
réduisant la diarrhée (Lundgren O.).
Cependant, aucune
étude électrophysiologique n'a encore
été réalisée avec BeI1,
contrairement à la chlorotoxine de Lqq.
BIBLIOGRAPHIE
Arseniev
A.S., Kondakov V.I., Maiorov V.N. NMR solution 3D structure of "
short " Buthus eupeus insectotoxin I5A. FEBS Lett.1984, 165 : 57-62.
Bernstein
D.I., Sack D.A., Reisinger K. et al.
Second-year
follow-up evaluation of live, attenuated human rotavirus
vaccine 89-12 in healthy infants. J. Inf. Dis. 2002, 186 : 1487-9.
Bontems
F., Roumestand C., Gilquin B. et al. Refined structure of charybdotoxin
: Common motifs in scorpion toxins and insect defensins.
Science 1991, 254 : 1521-3.
Bowman
G.D., Nodelman I.M., Levy O. et al. Crystal structure of the
oligomerization domain of Nsp4 from rotavirus reveals a core
metal binding site . J. Mol. Biol. 2000, 304 : 861
Brown
G.B., Johnston J.A. & Tolbert
L.C. The effect of
toxin from Leirus Quinquestriatus scorpion venom on the
polymerization and stability of microtubules.
Toxicon 1983, 21 : 699-708.
Brunet
J-P., Jourdan N., Cotte-Laffitte J. et al.
Rotavirus
infection induces cytoskeleton disorganization in human
intestinal epithelial cells : Implication of an increase in
tracellular calcium concentration. J. Virol. 2000, 74 : 10801-- .
Chang
K.O., Kim Y.J. & Saif L.J.
Comparisons of
nucleotide and deduced amino acid sequences of NSP4 genes of
virulent and attenuated pairs of group A and C rotaviruses.
Virus
genes 1999, 18 :
229-33.
Cohen J.
Medicine. Rethinking a vaccine's risk.
Science 2001, 293 : 1576-7.
Grishin
E.V., Volkova T.M. & Soldatova L.N.
Toxic components
from the venom of Caucasian (USSR) subspecies of scorpion
Buthus eupeus. Bioorg. Khim.1982, 8 : 155-64.
Lee
C-N., Wang Y-L., Kao C-L. et al. NSP4 gene analysis of rotaviruses
recovered from infected children with and without diarrhea.
J. Med.
Microb. 2000, 38 :
4471-7.
Lippens
G., Najib J., Wodak S.J. et al. NMR sequential assignments and
solution structure of chlorotoxin, a small scorpion toxin
that blocks chloride channels. Biochemiistry 1995, 34 : 13-21
Lorrot M. et
al. Rotavirus
infection enhances intestinal basolateral membrane Cl-/H+
symporter in young rabbits. Journée 2002 de la Recherche
" Le transcriptome/protéome ", 14.11.02, Fac. Pharmacie,
Châtenay Malabry, France.
Love S. &
Cruz-Hôfling M.A. Acute swelling of nodes of Ranvier
caused by venoms which slow inactivation of sodium channels.
Acta Neuropathol
(Berl) 1986, 70 :
1-9.
Lundgren
O., Peregrin A.T., Persson K.et al. Role of the enteric nervous system
in the fluid and electrolyte secretion of rotavirus
diarrhea. Science
Jan 21, 287 :
491-5.
Nishimura S. et al.
Detection of
rotavirus in cerebrospinal fluid and blood of patients with
convulsions and gastroenteritis by means of the reverse
transcription polymerase chain reaction.
Oldstone
M.B.A. Molecular
mimicry and autoimmune disease. Cell 1987,50 : 819-20.
Parashar
U.D., Bresee J.S., Gentsch J.R. et al.
Rotavirus.
Emerg. Infect.
Dis. 1998, 4 :
561-70.
Pothier
P., Kohli E. et Fromentin
C. Infections
à rotavirus. Médecine
thérapeutiquet pédiatrie 1998, 1 : 31-6.
Ruiz
M.C., Cohen J., Michelangeli F. Role of Ca2+ in the replication and
pathogenesis of rotavirus and other viral infections.
Cell
Calcium 2000, 20
:137-49 (Review).
Srivastava P.
Interaction of
heat shock proteins with peptides and antigen presenting
cells : Chaperoning of the innate and adaptive immune
responses. Annu.
Rev. Immunol.
2002, 20 : 395-425 (106 ref.).
Tran M.K.G.
Liste des
publications sur le modèle de la toxine du venin de
scorpion dans le Sida (voir plus
bas).
Vesikari T.
Congrès de
la Soc. Europ. Virol. Clinique, Stockholm, Suède, 3-5
Février 2000. In : Virologie, 2000, 4, n° 4 : 337.
Werner
T., Ferroni S., Saermark T. et al. HIV-1 Nef protein exhibits
structural and functional similarity to scorpion peptides
interacting with K+ channels. Aids 1991, 5 : 1301-8.
Zhdanova
L.N., Adamovich T.B., Nazimov I.V. et al.
Amino acid
sequence of insectotoxin I1 from the venom of middle-asian
scorpion Buthus eupeus. Bioorg. Khim. 1977, 3 : 485-93.
Zhang
L., Yu W., He T. et al. Contribution of human a-
défensin-1,-2 and &endash;3 to the anti-HIV-1
activity of CD8 antiviral factor. Science, 26 Sept 2002, on-line
10761851.
index
Tran
M.K.G. Liste des publications sur le modèle de la
toxine du venin de scorpion dans le Sida.
Tran
M.K.G., Kirkiacharian S., Maurisson G., Caprani A. Aids vaccine : The scorpion venom
model. The envelope gp41 protective sequence ELDKWA is a
scorpion venom loop active site. 13th Int. Symp.
HIV & emerging inf. dis., Toulon, 2002.
Tran Mong Ky Guy.
The scorpion venom
model of AIDS : Mimicry between anti-V3 loop antibody and
the sodium channel, the target of Tacrine : A possible
vaccine. 6 th
Europ. Conf. Clinical Aspects and Treatment of HIV
Infection. Hamburg (Germany), Oct 11-15, 1997. Poster
475.
Tran
M.K.G., Kirkiacharian S., Nguyen D.X. Homology between HIV Nef, scorpion
venom and sodium channel degenerin family. Tacrine, a K+
potassium flux modifier, as an anti-Nef drug ?
6 th Europ. Conf.
Clinical Aspects and Treatment of HIV Infection. Hamburg
(Germany), Oct 11-15, 1997. Poster 476.
Tran Mong Ky Guy.
Molecular homology
between HIV2 envelope third variable loop and scorpion venom
Buthus Eupeus. 8ème Symposium
Méditerranéen sur l'infection à VIH.
Toulon (France), 10-11 Mars 1995. P33.
Tran
M.K.G., D.X. Nguyen. Tacrine breakthrough : HIV envelope
hides 2 complete scorpion venoms, which bind to the sodium
channel. 2 nd Int.
Congress on Drug Therapy in HIV Infection. Glasgow
(Scotland), Nov 19-22, 1994. P113.
Tran
M.K.G., Fredj G., Maurisson G. HIV1 envelope V3 loop mimics
scorpion and spider neurotoxins, whose receptor, the Na+
sodium channel, is the target of tacrine (THA,
tetrahydroaminoacridine). IXth Int. Conf. AIDS, Berlin, June
1993.
Tran
M.K.G., Fredj G., Maurisson G. Molecular mimicry between HIV1
envelope gp110 third variable loop V3 and arthropod
(scorpion and spider) neurotoxins, whose receptor is a
sodium channel. IV
Int. ARTAC Workshop Therap. Trials in Cancer &
AIDS, Paris, Sept
1991 (organized by Belpomme)
Tran M.K.G.
Autorisation de
publier la figure 1a accordée à : Garry RF et
al. Similarities of viral proteins to toxins that interact
with monovalent cation channels. Aids 1991, 5 :1381-4.
Tran M.K.G.
Homology of HIV-1
gp120 with venoms (scorpion, sea anemone, cobra cytotoxin)
whose receptors are ion channels (Na+,
acetylcholine-regulated, Ca++). XIX int. Congress
Pediatrics. Paris,
July 1989 (organized by Griscelli C.) (abstract
M-24).
|
